农药残留限量标准及检测方法（二）
农药残留的前处理及检测
一、样品前处理
以往的提取和净化方法基本上是加入乙腈后用高速组织匀浆后静止或离心，取上清液浓缩后用固相萃取柱净化，上机测定。目前应用比较多的前处理方法是QuEChERS方法，其原理是分散固相萃取，减少了浓缩步骤。
1、分散固相选择取决于基质和分析物
MgSO4在所有净化试剂盒中均含有，起到去除水分的作用
PSA* 去除极性的有机酸，一些糖类和脂类
C18EC去除脂类和固醇，类胡萝卜素等
GCB*去除色素，如叶绿素（对平面结构药物会有吸附）
dispersive-SPE(d-SPE)
无论是EN 还是 AOAC 方法，C18对净化的影响大于PSA
针对不同基质的通用净化包，兼顾净化效果与回收率
（1）多数蔬菜和水果:PSA+MgSO4
去除极性有机酸,一些糖和少量脂肪类
蔬菜和水果>1%Fat, PSA+C18EC+MgSO4
去除极性有机酸，糖类，脂肪,和一些类固醇
（2）带色素的蔬菜和水果：PSA+GCB+MgSO4
去除极性有机酸，糖类，少量类胡萝卜素和叶绿素，不能用于平面结构农药
含有高水平色素含量的水果和蔬菜:PSA+GCB↑+MgSO4
去除极性有机酸，糖类，类胡萝卜素和叶绿素，不能用于平面结构农药
（3）带有色素和脂肪的蔬菜和水果:PSA+GCB+MgSO4+C18
去除极性有机酸，糖类，脂肪，类胡萝卜素和叶绿素，不能用于平面结构农药
1、样品前处理流程
2、影响农药回收率的因素
pH敏感农药：提取液的酸碱度
碱-不稳定农药
酸-不稳定农药
酸性农药
热不稳定农药：萃取放热影响
平面结构农药：石墨化炭黑的影响
（1）碱-不稳定农药
如克菌丹、灭菌丹、抑菌灵和其它在QuEChERS 提取之后的碱性PSA 净化步骤中不稳定的农药.考虑到这些农药的稳定性，净化后的样品溶液可以使用甲酸/乙酸调节pH至5来保证这些化合物的回收率.
（2）酸-不稳定农药
酸-不稳定农药如乙氧喹啉和吡蚜酮，若回收率不理想，可将提取盐中的0.5 g 柠檬酸二钠盐和1g的柠檬酸三钠盐换成 1.5g柠檬酸三钠盐，控制较低的提取温度来提高回收率。
尤其对于 乙氧喹啉在pH 5的提取溶液中会降解, 需要加快前处理的速度或者直接选用不缓冲的提取试剂。
（3）热不稳定农药
提取盐类的加入顺序，直接影响到热不稳定农药的回收率。
由于QuEChERS方法使用乙腈作为提取剂，不能直接用于气相色谱或气质联用，否则乙腈会对色谱柱造成损伤。
下图为气质联用仪直接进乙腈后样品峰面积的变化。测定溶液需要进行转溶，用氮气吹干，再加丙酮或正己烷溶解，但转溶易造成损失，且影响分析速度。
GC-MS/MS部分
当溶剂为乙腈，以SPL进样口进样时，第15次进样、第207次进样第393次进样甲胺磷峰型的变化。
比较好的一个克服方法是使用程序升温进样口，这样可以将乙腈先吹掉，再进行样品的分析。目前岛津公司气质质安装此装置，解决了不能直接进乙腈的问题，大大提高了分析的速度。
下图为安装程序升温进样口后进行的情况。以PTV进样口进乙腈溶剂的样品甲胺磷峰型变化
三、定性检测中易出现的问题
定性检测中易出现的问题有二类：
假阳性；
假阴性。
假阳性主要是因为：基质干扰；污染（交叉污染）。
1、基质干扰
（1）葱、蒜、韭菜
由于葱蒜类蔬菜含有蒜氨酸类物质（烷基硫代半胱氨酸及亚砜类化合物）及其活性酶（蒜氨酸酶）。在完整的细胞内酶和底物是分开存在的，但样品制成匀浆的的过程中，细胞破裂，酶会和底物发生反应，产生丙酮酸、氨及磺酸类的含硫化合物，这类物质与有机磷和有机氯农药性质相似，传统的净化方法不能将其去掉，用GC或GC/MS不能很好的检测。
为防止酶与底物发生反应，可将样品切断取25 g，用用微波加热20 s~30 s，进行提取处理。
（2）十字花科蔬菜（结球甘蓝、大白菜、普通白菜、花椰菜）
含有硫氰酸酯和异硫氰酸酯类化合物，用GC检测时有干扰。
甲胺磷、乙酰甲胺磷、氧乐果、三唑酮等。
（3）其他类产品：香菇、香料、芫荽、茶叶
含有小分子风味物质造成干扰。
解决的方法是使用GC-MS/MS或LC-MS/MS。
2、污染（交叉污染）
（1）试剂不纯
目前部分试剂不纯，会对检测造成污染。
每进一批试剂，按照检测方法标准的要求进行验证。
（2）检测用器皿
检测用器皿处理过高含量的样品，没有清洗干净。
检测前对所用器皿用丙酮、正己烷进行zui后的清洗。
（3）试样制备过程
试样制备时样品的交叉污染。
对试样制备的工具进行清洗，每个样品是被后都要进行清洗。
（4）进样过程
进样针污染，柱头或进样垫污染，针头清洗液污染；
前一针待测组分含量高，针头清洗不充分；
两针进样时间间隔过短，前一针残留物对下一针产生污染。
1、假阴性主要原因为：
（1）提取过程
方法不合适，提不出来。
改进提取剂和提取条件。
酸碱度不合适，有些农药对酸碱敏感，在酸性或碱性条件下不稳定分解。
要提供弱酸性或中性环境进行提取
（2）进样过程
温度过高，农药分解，如敌百虫、辛硫磷；
流动相pH值不合适，造成被测组分分解。
（3）浓缩过程
旋转蒸发或氮吹过干。
（4）净化过程
淋洗剂不合适；
净化柱选择不合适，吸附；
（5）基质干扰
测定百菌清和乙酰甲胺磷时，十字花科蔬菜有干扰。
四、定量检测中易出现的问题
1、标准溶液
农药残留检测的定量是与标准溶液比较得到，标准溶液质量浓度的准确性就十分重要。检测用标准溶液一定要在有效期内，且储存条件要符合要求。
新配制的标准溶液做一个谱图保存，以后该标准溶液使用时，在仪器条件相同的情况下，再使用该标准溶液时与第一次的谱图做比较，如果差异不大可继续使用，如果差异大要重新配制。
2、基质效应
基质效应影响定量结果，可造成检测结果的偏高或偏低，在检测过程中必须进行消除。
（1）基质效应的含义和类型
基质效应指样品中除目标化合物以外的其它成分对目标化合物响应值的影响。根据基质对目标化合物响应值的不同影响，基质效应可分为：基质增强效应；基质抑制效应。
（2）基质效应其表现
共流物或共流离子，分析物与谱库或标准质谱图匹配度低；无法准确地定性定量。
吸附或促进农药降解，回收率低。
基质诱导增强效应，回收率高。
（3）引起基质效应的物质来源
内源性杂质：指样品经过前处理过程后依然保留在待分析样品溶液中的各种有机物（脂类、色素、糖类、可溶性蛋白或肽类、胺类及目标物化合物的同系物及其代谢物等）或无机物（各种无机盐）；比如色素对ESI和APCI都产生明显的离子抑制。
外源性杂质：无机离子、缓冲溶液、有机酸、离子对时机、表面活性剂、固相萃取材料及色谱柱固定相流失物等。
同一化合物在不同的基质中其基质效应不一样，不同化合物在同一基质中也各有不同的基质效应。
（4）去除基质效应的方法
近一步净化；（如果是多组份分析这种方法难度很大）
提高色谱分离度；
MRM(二级MS)；
加入保护剂，常用的分析保护剂为含有多羟基基团的化合物；
用不含待测物的基质配制标准溶液；
抽用标准加入法；
用同位素内标法进行定量；
稀释zui后的定容提取液；
减少样品的进样体积
解卷集软件；
不同的离子化方式（CI）。
（5）用基质标准溶液校正
基质标准溶液, 即将空白样品经前处理后,加入一定量待测物标准, 用以对检测结果进行校正。
用基质标准溶液校正,是zui常用的补偿基质效应的方法。
而在确立仪器分析方法的zui后一步，往往通过分析基质标准溶液，确认zui终MRM抽集参数：zui佳特征离子对，并调整离子对丰度比（离子比率）。
对每一种蔬菜都用其基质标液矫正，工作量巨大。在日常检测工作中，zui好对蔬菜进行分类检测，即对每类蔬菜做一个基质标样，这样大大减少由于不同基质产生的干扰，更好地保证结果的准确性。
每类蔬菜做一个基质标样，这样做得到的结果zui准确！蔬菜种类很多，并且相同种类的蔬菜数量较少，可以用某一种基质配制标样来定量几种基质与其比较相近的样品。
瓜类蔬菜中的西葫芦黄瓜；
水果中的桃子苹果；
绿叶类蔬菜菠菜油麦菜；
十字花科类蔬菜甘蓝花椰菜等。
蔬菜的基质类型越相近，分析方法所得到结果的准确度越高。
五、测定
标准中都要求做标准工作曲线，实际检测时都是用单点标准溶液进行测定。标准中基本上都使用外标法进行定量，但要求样品中被测组分质量浓度应在标准工作曲线质量浓度范围内。单点校正也是外标法的一种，前提是必须在标准工作曲线范围内，在测定时要注意。
六、结果报告
当测定结果小于方法检出限时报告为未检出，写出小于方法检出限；
当测定结果大于方法检出限且小于方法定量限时,报告为定性检出；
当测定结果大于方法定量限时，报告定量结果。
七、检测工作中存在的问题
在农残检测中，只测定母体，不测定其代谢产物。
测定克百威时：测定三羟基克百威。
测定涕灭威时：测定其砜和亚砜。
测定甲拌磷时，测定其砜和亚砜。
测定甲基硫菌灵时：测定多菌灵和甲基硫菌灵。
测定氟虫腈时：测定氟甲腈、氟虫腈硫醚、氟虫腈砜。
八、精密度
每个检测方法结果计算时，对两次平行测定结果都有精密度的要求，部分检测机构的检测原始记录中，没有列此项内容。没有精密度的要求，就无法判定测定的两个平行结果是否能满足方法精密度规定的要求，如果超过方法精密度的要求，该测定结果要重做。
精密度：在规定条件下，相互独立的测试结果之间的一致程度。
精密度包括重复性和再现性两个部分。
重复性：在重复性条件下，相互独立的测试结果之间的一致程度。
重复性条件：在同一实验室，由同一操作者使用相同设备、按相同的测试方法，并在短时间内从同一被测对象取得相互独立测试结果的条件。
精密度（重复性）的三种表示方法：
（1）当精密度用项表示时：在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝 对差值不大于……。
（2）当精密度用相对项表示时：在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝 对差值不大于这两个测定值的算术平均值的……%。
（3）当精密度与分析浓度有关时：在重复性条件下获得的两次独立测试结果的测定值，在以下的平均值差范围内，这两个测试结果的差值不超过重复性限（r）。重复性限（r）抽用线性内插法求得。
示例：种农药组分添加含量是0.1mg/kg时，重复性限(r)为0.04；添加含量是0.5mg/kg时，重复性限(r)为0.20；当两次平行测定结果分别为0.32mg/kg和0.40mg/kg时，利用线性内插法计算，该次测定精密度是否符合要求。
Y=y1+(y2-y1)×(x-x1)/x2-x1
Y=0.04+(0.2-0.04)x(0.36-0.1)/(0.5-0.1)=0.144
0.4-0.32=0.08 小于0.144，符合要求
