霉菌试验形态的观察

霉菌形态的观察

一．基本原理

霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，而而孢子很容易飞散，制作标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片特点是：（a）细胞不变形；（b）具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间；（c）溶液本身呈蓝色，有一定染色效果。

玻璃纸透析培养法是利用玻璃纸的半透明特性及透光性，将霉菌生长在覆盖于琼脂培养基表面的玻璃纸上，将长菌的玻璃纸剪取一小片，贴放在载玻片上用显微镜观察。此法能得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态。

二.器材：

曲霉、青霉。乳酸石炭酸棉蓝染色液，查氏培养基，无菌吸管，载玻片，盖玻片，解剖刀，玻璃纸等。

三．操作步骤

1.一般观察法

于洁净载玻片上，滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落的边缘处取小量带有孢子的菌丝置染色液中，再细心地将菌丝挑散开，小心地盖上盖玻片，注意不要产生气泡。置显微镜下用低倍镜观察，必要时再换高倍镜。

2.玻璃纸透析培养观察法

（1）向霉菌斜面试管中加入5ml无菌水，洗下孢子，制成孢子悬浮液。

（2）用无菌镊子将已灭菌的、直径与培养皿相同的圆形玻璃纸覆盖于查氏培养基平板上。

（3）用1ml无菌吸管吸取0.2ml孢子悬浮液于上述玻璃纸平板上，并用无菌玻璃刮棒涂抹均匀。

（4）置于28℃培养箱内培养48h后，取出培养皿，打开皿盖，用镊子将玻璃纸与培养基分开，再用剪刀取一小片玻璃纸置载玻片上，用显微镜观察。

实验七  显微镜下霉菌孢子的计数

目的：学会并掌握利用血球计数板测定孢子数的原理和方法。

原理：计算单位体积内微生物细胞数目的方法很多，有平皿培养法、光密度法、血球计数法等，其中后者具有直观、简便和快速等优点，适合于单细胞菌体和孢子的计数。其原理是，将经过适当稀释的菌体细胞或孢子悬浮液，加到血球计数板的计数室内，在显微镜下逐格计数。因为计数室的容积是固定的（0.1mm3），可将在显微镜下计得的菌数或孢子数换算成单位体积试样中的菌数。由此法得到的结果是死菌和活菌的总数。

血球计数板是一块特制的载玻片，中部有H形的沟槽将中部分成上下两个计数室。如图4～6所示。计数室方格的边长为3mm，每个方格分成9个大方格,正中央的大方格被分成16个中方格，每个中方格又分成25个小方格，这样正中央的大方格总共分成400个小方格，每个小方格的边长为1/20mm，每个小方格的体积为1/4000mm3（计数室的高度为0.1mm）。每一立方毫米的细胞数为每一小方格的细胞数×4000。由此得到如下公式：每一毫升的菌数（个）=（平均每个中方格中的菌细胞数/25）×稀释倍数×4000×1000。

材料：

1.菌种：霉菌

2.血球计数板，试管、无菌水、无菌滴管，吸水纸，擦镜纸，振荡器。

方法

1.制备菌悬液：向菌种斜面加信10ml无菌水，用无菌接种环刮下菌苔后，在振荡器上充分振荡，适当稀释，待用，菌浓度以每小格内含1～2个细胞为宜。

2．加菌液：先用擦镜纸将血球计数室擦净，用无菌滴管取少许菌液分别滴入上、下两个计数室内，盖上专用的盖玻片，juedui不能有气泡，否则重做。

                                  图4血球计数板构造正面图

3.计数：先在显微镜下找到计数室，在正中央的大方格中沿对角线取9个中方格，分别计数每个中方格的菌数。

图5 血球计数板构造

(放大后的方格网,方格网的中央为计数室)

16×25

图6 计数室

实验八  菌种的保藏

菌种的保藏方法有多种，根据实验室具体条件与需要选择可行的保藏方法。

1．斜面低温保藏法

将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待霉菌充分生长后，通常是霉菌培养14d形成孢子后，棉塞部分用油皮纸包扎好，移至2℃～8℃的冰箱中保藏。保藏时间一般为2～4个月，移种一次。

此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需要特殊设备，能随时检查所保藏法的菌株是否死亡、变异与污染等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。

2．液体石蜡保藏法

将液体石蜡分装于三角瓶内，塞上棉塞，并用牛皮约包扎，1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30min，放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，如此反复灭菌三次，备用。

将需要保藏的菌种，在Zui适宜的斜面培养基中培养，使得到Zui健壮的菌种或孢子。

用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。

将试管直立，置低温或室温下保存。

此法实用而效果好。霉菌可保藏2年以上不死。此法的优点制作简单，不需要特殊设备，不需要经常接种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。

3．滤纸保藏法

将滤纸剪成0.5cm×1.2cm的小条，装入0.6cm×8cm的安瓿管中，每管1-2张，塞以棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30min。

将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使其充分生长。

取灭菌脱脂牛乳1～2ml滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。

用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。

将安瓿管放入有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干。

将棉花塞入管内，用火焰将安瓿管从中间熔封，保存于低温下。

需要使用菌种，复活培养时，可将安瓿管口在火焰上烧热，滴一滴冷水在烧热的部位，使玻璃破裂，再用镊子敲掉口端的玻璃，待安瓿管开启后，取出滤纸，放入液体培养基内，置温箱中培养。

采用此法保菌种保藏时间在2年左右，某些丝状真菌可保藏14～年之久。此法较液氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备。

4．沙土保藏法

取河沙加入10%稀盐酸，加热煮沸30min，以去除其中之的有机质。

倒去酸水，用自来水冲洗至中性。

烘干，用40目筛子过筛，以去掉粗颗粒，备用。

另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。

烘干，碾碎，通过100目筛子过筛，以去除粗颗粒。

按一份黄土、三份沙的比例（或根据需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土）掺合均匀，装入10mm×100mm的小试管或安瓿管中，每管装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌，烘干。

抽样进行无菌检查，每10支沙土管抽一支，将沙土倒入肉汤培养基中，37℃培养48h，若仍有杂菌，则需要全部重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌，方可备用。

选择培养成熟的（一般孢子层生长丰满的，营养细胞用此法效果不好）优良菌种，以无菌水洗下，制成孢子悬液。

于每支沙土管中加入给0.5ml（一般以刚刚使沙土润湿为宜）孢子悬液，以接种针拌匀。

放入真空干燥器内，用真空泵抽干水分，抽干时间越短越好，务使在12h内抽干。

每10支抽取一支，用接种环取出少数沙粒，接种于斜面培养基上，进行培养，观察生长情况和有无杂菌生长，如出现杂菌或菌落数很少或根本不长，则说明制作的沙土有问题，尚须抽样检查。

若经检查没有问题，用火焰熔封管口，放冰箱或室内干燥处保存。每半年检查一次活力和杂菌情况。

需要使用菌种，复活培养时，取沙土少许移入液体培养基内，置温箱中培养。

此法多用于产生孢子的微生物如霉菌、放线菌，在抗生素工业生产中应用Zui广，效果亦好，可保存2年左右，但应用于营养细胞效果不佳。

5．液氮冷冻保藏法

准备安瓿管 用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75mm×10mm的，或能容1.2mm液体的。

加保护剂与灭菌 保存细菌、酵母或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安瓿管塞上棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃灭菌15min。若作保存霉菌菌丝体用则需要在安瓿管内预先加入保护剂如10%的甘油蒸馏水溶液或10%二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用1.05kg/cm2，121.3℃灭菌15min。

接入菌种 将菌种用10%甘油蒸馏水溶液制成菌悬液装入已灭菌的安瓿管，霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安瓿管内，用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。

冻结 再将已封口的安瓿管以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，降低存活率。

保藏 经冻结至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器的小圆筒内，再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氨保藏器内的气相为-150℃，液态氮内为-196℃。

恢复培养 保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入38℃～40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。

此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，性状不变异。缺点是需要特殊设备。

6．冷冻干燥保藏法

此保藏方法为菌种保藏方法中Zui有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及芽孢菌都适用，对一些很难保存的致病菌，如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年，但设备和操作都比较复杂。这里不再介绍。

实验九  霉菌试验流程及操作

目录

一.试验前的准备

1.制备培养基

2.接种、培养

3.试验样品的交接及外观检查录

4.试验设备灭菌及调试

5.试验所需用具及试验室灭菌

6.制备无机盐溶液和营养液

7.准备对照样品

8.安装试验样品及对照样品

9.样品预处理

10.制备混合孢子悬浮液

11.孢子记数

12.孢子活力检验

13.样品接种

14.试验运行

15.试验后样品检查

16.试验结果与长霉等级评定

二.出具试验报告并归档

一、试验前的准备

1.制备培养基

霉菌试验中常用的培养基有：查氏培养基（Ca）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。菌种保存时查氏培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）应交替使用,以防止菌种退化。

培养基的种类、成分的配比，所用的器皿，制备方法，灭菌，摆斜面，倒平板同实验三。

2.接种及菌种培养

试验菌种来源必须是经由国家认可的菌种保藏或研究机构提供的纯菌种。

菌种名称和菌种编号应与试验标准有关条款规定的菌种一致。GJB150·10―83的试验菌种如下:

接种前，先检查试验用菌种的纯度，如发现菌种不纯或被污染应及时更换。接种时通常应准备二套，一套用作试验另一套用作备份或保藏。

接种的方法和菌种培养同实验四。

3.试验样品的交接及外观检查记录

试验协议书签订后进行试验样品的交接。仔细记录试验样品的初始状态，逐一详细地进行外观检查并作记录，必要时进行拍照。若有关技术文件规定在试验前需要对试验样品进行处理时，在试验72h前按要求进行处理。若试验样品需要进行性能检测时，应在试验前检测完毕，并作好检测记录。

4.试验设备灭菌及调试

试验前先对试验设备包括试验箱、储水箱进行冲洗，更换湿球纱布并给湿球纱布储水槽加蒸馏水至标线位置，给储水箱加满蒸馏水等工作，关试验箱门后用臭氧或紫外线灯灭菌。

根据试验条件调试试验设备24h，当确定试验设备能力达到霉菌试验标准规定的试验条件后，关机待用。

5.试验所需用具及试验室的灭菌

试验所需用具一般包括150ml磨口锥形瓶5个（瓶中含有45ml蒸馏水和50—75粒直径为5mm的玻璃球）、直径5cm玻璃漏斗5个、50ml量筒2个、玻璃棒数根、离心试管30根(分成6捆包扎)、试管塞30个、蒸馏水1000ml、20ml磨口试管5根、移液管5支、喉头喷雾器1个、4层过滤纱布5块，数块清洁纱布、培养基平板5个、150ml容量瓶1个等。准备好后依次进行高压湿热灭菌。

试验室和操作工作台用臭气发生器或紫外线灯进行灭菌。

6.制备无机盐溶液和营养液

 无机盐溶液和营养液按如下成份进行称量，再溶解到无菌水中，充分溶解后备用。

无机盐成分:

磷酸二氢钾（KH2PO4）      0.7g

磷酸氢二钾（K2HPO4）      0.7g

硫酸镁(MgSO4·7H2O)       0.7g

xiaosuanan（NH4NO3）          1.0g

氯化钠（NaCl）          0.005g

硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）  0.002g

硫酸锌（ZnSO4·7H2O）   0.002g

硫酸锰（MnSO4·H2O）    0.001g

蒸馏水                 1000ml

pH值                 6.0～6.5

营养液的成分:

甘油                    10.0g

磷酸二氢钾（KH2PO4）      0.1g

xiaosuanan（NH4N03）          0.1g

硫酸镁（MgSO4·7H2O）   0.025g

酵母膏                  0.05g

蒸馏水               加至100ml

pH值                     5.3

7.准备对照样品

对照样品应选用白棉布或滤纸，尺寸约3×13cm，数量不少于3件。对照样品先在沸水中煮沸10min，在无菌烧杯滴干水份，按照所用的标准要求将对照样品再浸泡在营养液数分钟，取出，在无菌状态条件下凉干。

8.安装试验样品及对照样品

试验样品置放在样品架上或悬挂到挂钩上悬挂，应尽量减少其接触部分，试验样品与试验样品之间距离应大于5cm，与箱壁间距离应大于10cm，样品之间的距离应保持空气自由流动。

对照样品垂直悬挂在箱门与试验样品同高，靠近试验样品处，不与样品接触。