皮肤刺激性ISO10993-10:2010检测
细胞毒性ISO10993-5:2009检测
迟发型超敏反应ISO10993-10:2010检测等生物相容性报告测试欢迎与我联系
ISO 10993-5:2009体外细胞毒性测试标准解读
对于与人体（皮肤、粘膜、组织、骨、血液等部位）接触的医疗器械，厂商都要进行体外细胞毒性测试，来证明产品的安全性。目前，ISO10993-5:2009是国际上关于体外细胞毒性测试的zui新标准，也是厂商开展这项测试的重要参考。小编今天想和大家仔细讨论该标准的要求，并带领大家了解如何开展体外细胞毒性测试。
ISO10993-5:2009标准概述
考虑到开展体外细胞毒性测试的产品和材料有很多，ISO10993-5并没有针对某种样本做特定要求，而是为不同产品和材料提供了测试选择。通常,测试可以分为三类：提取物测试、直接测试及非直接测试。厂商要根据样本特性及预期使用，来决定测试类型。
当然，不同测试类型会有相应的样本制备及细胞培养要求。zui后，厂商可以在四种评估方式（形态学方法评估细胞损伤、细胞损伤测定、细胞生长测定、特定的细胞代谢测定）中进行选择，评定样本的细胞毒性水平。
标准适用范围
该标准描述了评估医疗器械体外细胞毒性的测试方法，这些方法明确了培养细胞与样本或样本提取物直接（或间接）接触的孵育过程，并且使用适当的生物学参数评定哺乳动物细胞的生物学反应。
重要定义
阳性对照品：指提供可再现的细胞毒性反应的阳性对照材料，来证明测试系统的响应性。例如，可用苯酚的稀释液作为提取物的阳性对照。
阴性对照品：指不会产生细胞毒性反应，且可以反应细胞背景响应值的材料。例如，用于合成聚合物的高密度聚乙烯，或用于牙科材料的氧化铝陶瓷棒。
空白对照品：指不含测试样品的提取液，保留在与容纳测试样品相同的容器中，并接受同样的测试条件，用于评估提取容器、载体和提取过程可能造成的影响。
样本制备
要明确测试对象是样本提取物还是样本本身。如果是液体浸提物，则要注意几个主要影响因素：
1）温度：不要造成样本的重大改变，比如融合、融化或化学结构改变；2）提取介质：对于哺乳细胞系，建议使用的介质是去血清的培养基、生理盐水或其他适合的介质（如纯水和DMSO），zui好是与浸提样本时使用的浸提液保持一致；3）提取条件：包括容器、温度、时间、pH、悬浮物等等，关于具体要求，大家可以参考上一篇推文（启升原创丨ISO10993-12:2012 样本制备及参考品标准解读），小编在此不再赘述。
如果制备用于直接接触测试的材料，则要考虑：1）样本形状：一般而言，具有各种形状、大小或物理状态的材料（如液体、凝胶等）无需修饰就能进行细胞毒性试验，但如果是固体材料，样品应具有至少一个平坦表面；2）无菌性：避免细菌污染造成的错误结果；3）液体测试样本：直接沉积或沉积在生物惰性吸收基质上；4）：吸收测试样本：吸收性的测试样品应在测试前用培养基浸泡。
细胞系及细胞培养基
选择细胞系时，应考虑细胞的敏感性，要具有较好的生物学响应。通常将选好的细胞系冻存到-80℃含冷冻防护剂（二甲基亚砜或甘油）的培养基中，如果长时间冷冻则需保存在-130℃环境里。
使用的培养基要无菌，要满足所选细胞的生长要求。当然，在不影响测定结果的前提下，可以加入一定量抗生素进行抑菌。培养基的pH要保持在7.2-7.4之间。
测试内容
不管是浸提物测试，还是直接接触或非直接接触测试，zui少要重复3次。我们以表格的形式，帮大家梳理测试过程中的关键点。
01
浸提物测试
图片
02
直接接触测试
03
非直接接触测试
细胞毒性评定
通过定性或定量方法都可以确定细胞毒性，但定量评估通常是优选方法，而定性方法适用于筛选目的。如果是定性评估，可以使用细胞化学染色在显微镜下评估细胞的变化，例如膜完整性、细胞形态、空泡化、脱离和细胞裂解。正常形态的变化应以描述性或数字方式记录在测试报告中。
下表给出了对样品细胞毒性进行分级的方法（表1依据正常或裂解细胞的比例；表2依据测试样本外的染色范围），如果基于表1和2，分级数值都大于2则被认为具有细胞毒性作用。
如果是定量评估，可以通过测量细胞死亡、抑制细胞生长、细胞增殖或集落形成、细胞数量、蛋白质量、酶释放、活体染料释放或减少等测量参数，客观量化细胞毒性水平。
一般认为，细胞活力降低超过30％则具有细胞毒性作用，还包括将不同的截点或可接受的测试对照结果的比例作为评定标准。在ISO10993-5:2009的附录A-D，有列举具体的定量实例供大家理解参考。
测试报告
作为盖棺定论的一步，测试报告记录了测试的整个过程及结果。根据ISO 10993-5:2009要求，测试报告应至少包括以下细节：
a）测试设备的名称和地址；b）测试人员姓名；c）测试开始和结束日期；d）样本描述；e）细胞系，选择的理由和细胞来源；f）公司名称和培养基、血清和抗生素的批次；g）测定方法和基本原理；h）提取方法，包括浸提物性质和浓度；i）阴性及阳性或其他对照品；j）细胞反应和其他观察；k）评估结果所需的任何相关数据;l) 原始数据如何保存；m) 保密协议信息；n) 和方案不一致的地方的声明。
