防护服微生物检测方法

   近年来，较大规模传染病疫情和生物恐怖袭击事件在时有发生，为保护民众的生命安全，各国都越来越重视生物防护服尤其是高危生物污染环境个体防护服的研制由于我国尚没有相应的抗微生物悬浮液穿透性能检测技术标准和有效的验收制度，严重制约了我国为应对传染病和突发公共卫生事件而对高危生物污染防护材料与装备的研究目前，国内生产的生物防护服在微生物尤其对病毒防护方面存在一定问题，而高危生物污染环境作业人员防护装备全部依赖进口，价格昂为此，本研究参照ISO04接触血液和体液进行防护的服装一防护服材料抗血源性病原体穿透性能的确认方法一噬菌体Phi-X174试验方法》（GB19082-2医用次性防护服技术要求》〔，建了高危生物污染环境生物防护服材料抗微生物穿透性能的检测评价方法，在此基础上，除了采用噬菌体Phi-X174外，还增加了脊髓灰质炎病毒、枯草杆菌黑色变种芽抱白色念珠球菌作为挑战微生物人工合成血液作为渗透样品，对我国自行研制的高危生物污染环境个体防护服面料样品进行了抗微生物悬浮液和人工合成血液的穿透性能检测，拟为高危生物污染工作人员防护服的研制提供科学依据。

    1材料与方法

   1.1菌株、病毒与细胞枯草杆菌黑色变种芽抱(ATCC9732白色念珠球菌（ATCC10231)噬菌体Phi-X174及寄主大肠杆菌（ATCC13706）购自美国典型培养物保藏中心ATCC）；脊髓灰质炎病毒型疫苗株LSC2ab株（PVl）为实验室保存株，其宿主细胞采用Vero细胞，购自中国科院上海细胞所

    1.2生物防护材料及其待检面料样品的处理

   检生物防护材料为’I'PU膜复合材料和PU涂层，均由军医学科学院卫生装备研究所提供游标卡尺测待检面料样品的平均厚度，物理天平测量面料的单位质量制备待检面料样品时，破坏性地从生物防护材料上裁剪呈80直径大小的圆形样片，经紫外线灭菌10min后备用选择医用包扎聚醋膜作为阴性对照。

    1.3挑战微生物悬浮液的制备及其检测方法

   菌体Phi-Xl74的培养及其挑战悬浮液的制备参照04〕和GB19082-2()()1)〕执行，其滴度测定采用双层平板计数法〔〕；枯草杆菌黑色变种芽抱悬浮液、白色念珠球菌悬浮液和PVl的培养及其挑战悬浮液的制备均参照文献〔〕；浓度或滴度的测定均采用终点稀释法，其中，芽抱的培养采用营养琼脂培养基，白色念珠球菌的培养采用沙堡培养基，PVl培养采用1640培养基〔人工合成血液参照文献〕方法自制，pH调节至7.30.1，其表面张力应保证为（0.0420.002)N/m通过培养，制备出种挑战微生物悬浮液进行测试其中：噬菌体Phi-X174滴度为x109町／ml枯草杆菌黑色变种芽抱浓度为1.1x107rnl;PVl滴度为2×1()5TCID50；白色念珠球菌的浓度为CFU/ml。

   1.4挑战测试方法由于ISO16604中已表达了防护材料抗代表性病毒穿透能力的流体静力学压力测试方法，故本文只对待检材料的防护性能进行评价试验仪器参照ISO16604(1〕制备通过装备提供的定压力来检测微生物悬浮液或人工血液能否透过防护服材料选择医用包扎聚醋膜作为阴性对照，相应的微生物样品为阳性对照取直径80的面料样品，外表面与挑战微生物悬浮液接触，放置在试验槽上，放好塑料垫片和钢制支撑网等，旋紧螺丝，试验槽内加入微生物悬浮液后，使面料样品在常压和不同的正压条件（1.75.520kPa）作用下测试min若肉眼可见液体从测试样品上渗出，则不再继续下一个压强的测试；否则，应继续在下一个压强上进行测试微生物测试时，每个压强测试完后，均取时相应的培养液冲洗防护材料内表面，收集冲洗液；测定挑战微生物悬浮液挑战前后的浓度或滴度对于人工合成血液穿透测试，只需目视检查是否穿透即可所有试验均测试。

    1.5生物相容性实验为观察待测材料是否影响

   挑战悬浮液中噬菌体的滴度，在进行生物防护服材料抗种微生物悬浮液和人工合成血液穿透能力测试之前，进行防护服材料生物相容性试验。参照ISO04〕执行，即将滴度为9001200町的噬菌体悬液?1与待检生物防护材料面料样本接触10min后，取出再进行滴度测定，观察面料是否影响1.6防妒材料抗微生物悬浮液穿透性能检测护材料抗微生物悬浮液和人工合成血液穿透性能的检测采用本单位与军事医学科学院卫生装备研究所合作研制的检测仪，检测仪是参照ISO16604设计其检测方法已通过对肝炎病毒（乙肝和丙肝）、人类免疫缺陷病毒等在血液和其他具有潜在传染性的体液中传播的病毒建立的穿透模型的测试用于该试验方法中的代表性微生物－噬菌体PhiXI74,在大小和形状上与丙型肝炎病毒（HCV）相似，并且也可代表乙型肝炎病毒（HBV）和人类免疫缺陷性病毒（HIV）。

    2结果

   2.1生物防护材料及其待检面料样品的物理性质待检材料分别为TPU膜、四膜复合材料和PU种材料，其主要物理性能参数见表lo

   2.2样本的生物相容性结果待检生物防护材料样本对种微生物悬浮液元明显抑制和杀灭效果，具有很好的生物相容性。

   防妒材料对不同微生物悬浮液的阻留效果在常压和不同正压条件下作用min后，分别观察生物防护材料对噬菌体Phi-X174、脊髓灰质炎病毒(PVl）、枯草杆菌黑色变种芽抱（SB）和白色念珠球菌（CA）的抗穿透作用。次重复试验的结果见表。由表可见，在常压和1.75,3.51420kPa压力作用下，待检种生物防护材料均能有效阻留挑战微生物的透过，阻留率均达百%。作为阴性对照，紫外照射消毒后的医用包扎聚醋膜的冲洗液中均未检出种挑战微生物；未检出悬浮空气传播的挑战微生物背景污染在常压和不同的正压条件下作用5min后，分别观察种生物防护材料对人工合成血液的抗穿透作用经过次重复试验，结果表明，在常压和1.75.51420kPa压力作用下，经种防护材料的阻留作用mir见人工合成血液透过防护材料的现象。

    3、讨论

   在高危生物污染环境作业的工作人员，包括医生、消防官兵、“防”军人，很容易接触到可能含有乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、人类免疫缺陷性病毒（田）等血源性病毒的血液、体液和其它具有潜在传染性物质1992年，IAFF的伤亡调查表明，每15个消防员中就有一个队员接触到传染病，这些传染病中有12.6%是肝炎B,21.9%艾滋病间，生物防护服作为传染性物质的屏障，对保护生命、维护健康具有重要的意义高质量的生物防护服，应该具有较高的生物防护标准与防护等级，可防止空气、粉末、液体中存在的各种微生物目前，国际上检测生物防护服抗微生物穿透性能的方法主要有正压法〔〕和负压法［日〕种，其中，我国执行的是总后勤部2003年公布的WSB58-2003《生物防护服通用规范》，利用脊髓灰质炎病毒（疫菌株）为挑战微生物，通过负压法观察材料阻隔微生物的性能。由于本研究提供的高危生物污染环境作业防护材料主要用于正压生物防护服的制备，该规范并不适用；而美国材料实验协会的防护服标准ASfMF1671-2003及ISO闹剧是利用阳在174作为挑战微生物，通过正压法测试待检材料是否能够抵御种微生物以及人工合成血液的穿透〔〕。本研究后采用ISO16制进行测试；为评价测试面料样品的生物安全性，本文选择了脊髓灰质炎病毒、枯草杆菌黑色变种芽抱、白色念珠球和人工合成血液进行测试。

    实验结果表明，叽膜、叽复合材料、PU涂层种防护材料在常压和不同正压条件下（1.7535

   1420kPa）阻留min，对上述种微生物的阻留率均达百%，也未见人工合成液透过现象本文结果为采用TUP膜、TUP复合材料和涂层种生物防护村米制作相关防护服提供了科学依据。

   目前，我国尚无正压生物防护服抗微生物穿透性能的测试仪器，也无相关的测试方法和标准此，本研究建立的正压生物防护服材料抗微生物穿透性能的测试平台，为今后相关测试方法和标准的建立、相关产品的质量监督检测和使用提供了一定的科学依据。