细胞毒性试验是指通过测定细胞毒性物质对细胞的作用,来评估其对细胞的毒性效应。常用的细胞毒性试验方法包括染料排斥法、比色法、荧光检测法、化学发光法等等。其中,*常用的方法是细胞坏死率(LDH)法。细胞毒性试验是评估细胞毒性物质毒性效应的重要方法之一,它可以帮助确定试验物质的安全性和可行性,为安全使用该物质提供科学依据。
细胞毒性试验方法可以分为体外细胞培养试验和体内细胞试验两种:
体外细胞培养试验方法:
提取物试验:适用于检测医疗器械可溶性物质的毒性,通常与动物毒性试验的结果一致。
直接接触法:检测医疗器械细胞毒性*灵敏的方法,具有较弱的细胞毒性,也可以测量医疗设备。
琼脂覆盖法:适用于毒性较大的医疗器械和批量过滤。
分子过滤法:适用于小分子量医疗器械毒性成分的生物相容性评价。
体内细胞试验方法:
细胞计数法:适用于检测组织器官细胞的数量和体积的变化。
X—射线晶体结构分析(CXBFA):通过分析细胞内化合物的晶体结构,可以推断出毒物的作用机制,用于解释毒理学数据。
流式细胞术:通过检测细胞表面分子的变化,可以确定毒物是否影响了细胞的功能。
细胞凋亡检测:通过检测细胞形态学上的变化和DNA断裂,可以确定毒物对细胞的损伤作用。
细胞动力学检测:通过检测细胞运动的变化,可以确定毒物是否对细胞造成了伤害。
分子生物学检测:通过检测基因表达的变化,可以确定毒物对细胞的作用机制。
细胞毒性试验通常包括体外细胞培养试验和体内细胞试验两种。
下面是这两种试验的细胞毒性试验流程:
体外细胞培养试验流程:
预实验:收集对数生长期细胞,根据细胞扩增传代时的细胞生长速度同比列计算出细胞生长84小时后汇合度达到****时的细胞铺板密度,以之作为中心密度,以1.25倍为梯度,往前/往后各梯度稀释4个密度,种到实验所用类型的细胞板中。
收集对数生长期的细胞,根据预实验结果稀释好细胞悬液,以50μL/孔接种到96孔板中(384孔板为25μL/孔),37℃5%CO2培养过夜。
待细胞完全贴壁后每孔加入50μL/孔(384孔板为25μL/孔)的待测工作液,37℃5%CO2继续培养72小时。
每孔加入10μL(384孔板为5μL)的CCK8试剂(注意不要产生气泡,会影响OD值的读数),37℃5%CO2孵育1~4小时。
用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。
数据计算:%抑制率=(1-(ODS-ODBLK)/(ODNC–ODBLK))×****
其中:ODS:样品孔的吸光值(细胞+待测化合物)ODNC:阴性孔吸光值(细胞+溶媒)ODBLK:空白孔吸光值(培养基+溶媒)
体内细胞试验流程:
处理流程:将处理好的细胞取出,吹打均匀后制片、洗片、晾干,进行相应的检测。